【正海新知】PCR实验室为什么要进行三区隔离？

PCR实验室总是出现假阳性，明明没有加模板，最后却扩出了产物。如果这种现象频频出现，就要注意一下操作环境了。

PCR反应过程中不断进行升温降温，液体蒸发又冷凝，PCR管中部分空气形成气溶胶，携带大量的DNA扩增产物（注意，1ng扩增产物中可作为模板的DNA片段数量，超过1ng起始模板中可扩增DNA片段数量的几百万倍甚至更高。比如人的基因组DNA有30亿个bp，要扩增的单拷贝基因片段是300bp，1ng起始模板中可以作为模板DNA片段只占总起始模板DNA总量的千万分之一）。如果在实验室打开含PCR扩增产物的管盖，大量携带DNA扩增产物的气溶胶就会涌出，扩散到空气中，从而对环境造成污染。

虽然在整个空间环境中DNA的含量很低，但由于理论上只要有1个可做为模板的DNA片段也能PCR扩增成功，这就是为什么在污染环境中阴性对照也能扩增出条带的原因。

所以在专业的PCR实验室（比如临床PCR检验实验室），通常有四区隔离（或至少是三区隔离）的要求。

常见的三区是指：

1、试剂配制区：PCR反应体系的配制区域。 

2、标本处理区：包括扩增模板的制备，即提取DNA的地方。

3、PCR扩增和产物分析区：进行PCR扩增的区域，也是扩增产物进行凝胶电泳分析的区域。 

如果将PCR扩增区域和产物分析区再次分开，就是四区隔离。四区隔离，主要目的是防止气溶胶在各个PCR区域之间的流动，最好的方法是每个区域隔一幢楼，但操作起来不现实，于是便有了针对不同区域设置正负压的方法： 

试剂配制区（Ⅰ区）：最洁净的区域，保持微正压使得外界空气无法进入隔离污染源。并且阴性模板应该在此区加入PCR管并盖盖，严禁在此区域打开、存放装有DNA模板的离心管。

DNA模板添加区（Ⅱ区）：压力比Ⅰ区低，保证内部空气不外泄，以免阳性模板的气溶胶对外界环境造成污染。

扩增及PCR产物分析区（Ⅲ区）：保持负压，使得内部空气不外泄，以免扩增产物的气溶胶对外界环境造成污染。

操作时压力遵循Ⅰ区→Ⅱ区→Ⅲ区单一方向进行，不可逆向进行。

既然PCR三区隔离的目的是为了阻断气溶胶的交流，请注意以下细节，思考一下气溶胶来自哪里：

 1. 每个区域都应配备专用的移液器，不可交叉混用。我们的一位用户拿电泳室的移液器加模板，阴性对照扩出了很亮的条带。 

2. 每个区域都应配备专用的移液器吸头，不可交叉混用。 

3. 如果条件允许，在PCRⅢ区工作结束后再次进入PCR I区需要更换实验服、一次性鞋套、帽子、手套。 

4. 在PCR I区、PCRⅡ区配备带滤芯吸头。